Centro Regionale Trapianti - Piemonte

Immunogenetica / Attività scientifica

  1. L'attività scientifica
  2. La riuscita dei trapianti dipende da numerosi fattori. Alcuni di essi sono collegati alle caratteristiche genetiche del donatore e del ricevente. Tradizionalmente le caratteristiche genetiche rilevanti ai fini dei trapianti sono i geni HLA. I polimorfismi di questi geni possono essere utilizzati per guidare la selezione del candidato più idoneo da trapiantare, anche se di fatto ciò avviene esclusivamente nel caso dei trapianti di rene. Numerosi altri geni, che sono polimorfici, possono comunque influenzare in vario modo l'esito del trapianto, ed assumere rilevanza clinica nelle diverse fasi del trapianto.

    Le principali linee di ricerca che vengono sviluppati presso la SC di Immunologia dei Trapianti (sede anche del laboratorio di Genetica dell'Istocompatibilità del Dipartimento di Genetica, Biologia e Biochimica) sono le seguenti
    1. Geni e trapianti
    Obiettivi di questa linea è sviluppare alcuni temi relativi all'impatto clinico di alcuni polimorfismi genetici e la buona riuscita dei trapianti d'organo.
    1. a. Geni e rigetto dei trapianti. Oltre ai geni classicamente coinvolti nel trapianto, come quelli HLA, vi sono numerosi geni i cui polimorfismi possono modificare la capacità di risposta del ricevente nei confronti dell'organo trapiantato. E' il caso, ad esempio, dei geni che codificano per citochine, chemochine, recettori, molecole di adesione e di attivazione. Esiste poi uno nuovo scenario che le conoscenza del genoma umano ha introdotto. Ad esempio, la conoscenza del background genetico del donatore può definire quegli organi che sono maggiormente a rischio di rigetto. Si vuole per questo valutare se i polimorfismi di altri geni HLA (come ad esempio il gene HLA-G) che condizionano una diversa espressione di queste molecole possono favorire o meno la tolleranza nei confronti del trapianto. La casistica a disposizione comprende almeno 300 trapianti di rene, 200 di fegato e 100 di cuore, con i rispettivi donatori.
    2. b. Geni e rischio di infezione in corso di trapianto. Se da una parte la terapia immunosoppressiva in corso di trapianto ostacola il rischio di rigetto, dall'altra può favorire il rischio di infezione. E' noto che numerosi geni (soprattutto quelli che codificano per proteine coinvolte nell'immunità naturale, come i geni delle defensine, del recettori Toll Like, CD14, MBL2) sono coinvolti nella variabilità di risposta individuale alle infezioni. Si vuole valutare il ruolo di questi polimorfismi nel rischio di complicanza infettiva dopo trapianto. Questo potrà permettere di identificare soggetti a rischio e avviare protocolli di prevenzione personalizzati. In una casistica retrospettiva, si vuole analizzare il polimorfismo dei geni delle beta defensine umane (e della loro variabilità di numero), del gene TLR-4, del gene CD14 e del gene MBL2, per mettere in relazione la presenza di eventuali varianti alleliche collegate a bassa produzione della proteina codificata dai geni analizzati con il rischio di infezioni dopo trapianto. L'analisi sarà condotta su 100 riceventi di trapianto polmonare (e sui relativi donatori),in considerazione del rischio di infezione in questa tipologia di trapianto.
    3. c. Geni e risposta ai farmaci. La farmacogenomica ha introdotto conoscenze sulla variabilità individuale alla risposta ai farmaci dovute a variazioni di geni coinvolti nel metabolismo dei farmaci stessi. Il ruolo di questi polimorfismi assume sempre maggiore rilevanza, se si considera l'importanza di una personalizzazione della terapia immunosoppressiva, che da una parte soddisfi le necessità di indurre tolleranza nei confronti del trapianto senza però essere eccessiva in modo da aumentare il rischio di infezioni e tumori. Si vuole avviare uno studio retrospettivo di genotipizzazione, sia nei riceventi che nei donatori, dei geni che codificano per gli enzimi CYP3A4 e CYP3A5 e per la pompa proteica P-glicoproteina (MDR-1). La casistica esaminata contemplerà almeno 100 pazienti sottoposti a trapianto epatico dal 1999 al 2006 (ed i rispettivi donatori) ed in terapia con il Tacrolimus. Inoltre verrà effettuata un'unica valutazione del profilo metabolico del tacrolimus. Si vuole verificare nel paziente sottoposto a trapianto di fegato, così come dimostrato nel paziente sottoposto a trapianto di rene, l'esistenza di una relazione tra i diversi genotipi degli enzimi CYP3A4 e CYP3A5 e della P-glicoproteina (MDR-1) e il dosaggio/kg del tacrolimus, studiando però non solo la presenza di polimorfismi nel ricevente ma anche nell'organo del donatore.
    4. d. Geni e recidiva di malattia nel trapianto. Numerose patologie suscettibili di trapianto presentano un rischio elevato di recidiva dopo l'intervento. E' questo, ad esempio, il caso di alcune glomerulopatie (come la nefropatia a depositi di IgA - IGAN - o la glomerulosclerosi focale -GSF) nel caso del trapianto renale o di alcune cirrosi (come quella da HCV) nel caso del trapianto di fegato. La presenza di alcune caratteristiche genetiche nel ricevente (ma anche nell'organo trapiantato) potrebbero aumentare o diminuire il rischio di recidiva della malattia, con comprensibili ricadute nella gestione clinica del paziente sottoposto a trapianto che presenti questa patologie. Ci si concentrerà su 100 trapianti renali (e rispettivi donatori) in soggetti con diagnosi di IGAN (nei quali saranno esaminati i polimorfismi HLA, GALT1 e GALT2, TGFbeta ) e di GSF (nei quali saranno esaminati i polimorfismi de geni NPH1 ed NPH2) e su 150 riceventi HCV+ (e rispettivi donatori), nei quali verranno esaminati i polimorfismi HLA, CD81 e KIR. Si valuterà il rischio di recidiva clinica e di laboratorio della malattia da HCV (ed i tempi di reinfezione) in sottogruppi di pazienti distinti in base al genotipo dei geni analizzati.

    2. Le caratteristiche immunogenetiche della popolazione italiana
    Uno dei problemi che ci si pone è quello di definire quali siano le frequenze dei genotipi e fenotipi HLA nella popolazione Italiana. L'archivio più esteso e meglio tipizzato per le caratteristiche HLA-A,B,C,DR e DQ è quello del Registro Italiano dei Donatori di Midollo Osseo (IBMDR - Genova), che raccoglie più di 315.000 soggetti, estesamente tipizzati per HLA. Ci si propone, in questa ricerca, di calcolare le frequenze dei diversi alleli, genotipi e fenotipi, avendo cura di valutare le diversità tra le regioni italiane. Questo potrà permettere di approntare una mappa delle caratteristiche immunogenetiche, e potrà fornire indicazione (almeno per i programmi di trapianto che utilizzano la compatibilità HLA quale elemento di selezione del candidato, quali quelli di trapianto renale) della probabilità di trapianto in funzione delle caratteristiche HLA del paziente che si iscrive in lista di attesa.

    3. Definizione di nuovi alleli HLA
    La regione HLA è di gran lunga la regione con maggiore variabilità del nostro genoma. Uno degli aspetti rilevanti della ricerca applicata in questo settore consiste nel definire sempre con maggiore precisione tutte le varianti (o alleli) presenti. Oggi questo si rende facilmente possibile dall'uso di metodi di sequenza del DNA e dell'indagine nelle famiglie. In considerazione del gran numero di tipizzazioni HLA che vengono eseguite, una parte degli sforzi sono destinati ad identificare e caratterizzare nuove varianti HLA

    4. Messa a punto ed applicazioni cliniche di test di immunologia cellulare che valutano la capacità di risposta immunitaria
    Le citochine sono importanti mediatori della reazione immunitaria e vengono prodotte da molti tipi cellulari (linfociti T, B, cellule dendritiche, ecc.) in risposta a stimoli differenti. Le citochine rappresentano un segnale di cambiamento nella normale fisiologia e possono promuovere molteplici meccanismi immunologici. Si consideri ad esempio l'attivazione dei linfociti T mediata da interleuchina-2 e interferone- ? (citochine Th1 che incrementano la risposta cellulo-mediata) oppure la proliferazione dei linfociti B promossa dall' interleuchina-4 (citochina Th2 che aumenta la risposta anticorpale). Misurare la produzione di citochine può quindi risultare importante per valutare parametri immunologici quali l'attivazione dei linfociti T o il tipo di risposta immunitaria (umorale o cellulare). La metodica più adatta a questo scopo è l' ELISPOT, che evidenzia le citochine secrete a livello di ogni singola cellula. In molti ambiti clinici, la possibilità di misurare la produzione delle citochine tramite l' ELISPOT è importante per comprendere l'entità della reazione immunitaria in corso. In letteratura esistono numerosi studi sulla metodica ELISPOT applicata all'infettivologia, all'oncologia, ai trapianti, all'allergologia e all'autoimmunità. La possibilità di valutare l'efficacia di una vaccinazione, identificare la risposta contro allergeni oppure fornire indicazioni sull'andamento di un trapianto di organo solido o di cellule staminali ematopoietiche sono obbiettivi che si pone il nostro laboratorio. Nel caso di trapianto di rene da vivente, si vuole valutare la relazione tra reazione immunitaria con l'outcome clinico (rigetto acuto e cronico). In questo ambito, la possibilità di ottenere cellule fresche dal donatore e dal ricevente in modo semplice, rende l'ELISPOT una metodica ottimale per il follow-up immunologico. Disponendo di materiale biologico a tempi determinati, la tecnica potrebbe evidenziare in modo molto preciso lo sviluppo dell'eventuale reazione immunitaria in corso tra donatore e ricevente. Il risultato, espresso in termini di cellule secernenti citochine, potrebbe rappresentare un valido ausilio al clinico per definire il rischio di rigetto del trapianto e stabilire eventuali modificazioni nella terapia immunosoppressiva. Nel caso di trapianto di cellule staminali ematopoietiche, si intende procedere con la valutazione della reazione immunitaria in termini di cellule che producono citochine e la correlazione con l'insorgenza di malattia del trapianto contro l'ospite (Graft-versus-host disease, GvHD). Il test potrà essere eseguito prima e dopo il trapianto per studiare l'evoluzione della GvHD. Il risultato del test, analogamente al trapianto d'organo solido potrebbe rappresentare un supporto decisionale per gli ematologi al fine di modulare la terapia immunosoppressiva nel paziente.

    5. Effetti clinici degli anticorpi anti-HLA
    La buona riuscita dei trapianti è collegata, tra l'altro, alla presenza di immunizzazione presente prima del trapianto, oppure che si manifesta dopo il trapianto. Sono disponibili diversi metodi per caratterizzare questa reattività anticorpale, da metodi più tradizionali come la Citotossicità dipendente dal complementi (CDC) saggiando il siero in esame con un pannello di cellule tipizzate per HLA (PRA), fino a tecniche più sofisticare di citofluorimetria in fase solida, dove le molecole HLA sono fissate su microsfere (tecnica Luminex). Nella pratica clinica si valuta abitualmente il tasso di immunizzazione nei candidati al trapianto, che per questo derivano - rispetto ai candidati non immunizzati - una maggiore difficoltà a reperire un donatore idoneo, che si traduce in una attesa più lunga, come pure un rischio di rigetto aumentato. Una quota variabile di candidati, ha sviluppato anticorpi anti-HLA, a seguito di eventi immunizzanti come trasfusioni, gravidanze e - soprattutto - pregressi trapianti. Meno chiarito è invece il ruolo della comparsa di anticorpi anti-HLA dopo trapianto. Alcuni dati indicano che - soprattutto con le attuali terapie immunosoppressive che hanno ridotto l'incidenza di rigetto mediato da cellule - la presenza di anticorpi dopo trapianto possano rivestire sempre maggiore rilevanza, in relazione anche alrigetto cronico. Questa ricerca si pone quindi come obiettivo di valutare prospetticamente, in una corte di 100 trapianti di rene, se la probabilità di successo del trapianto sia in relazione con la comparsa di anticorpi anti-HLA dopo trapianto, e con le loro caratteristiche (anti classe I, anti-classe II o entrambe)

    6. La banca Cornee
    Le cornee prelevate da donatore cadavere possono essere distribuite - se idonee al trapianto - dopo conservazione a 4°C per un massimo di 5-7 giorni, oppure conservate in coltura d'organo a 31°C, utilizzando terreni specifici, per un periodo di tempo compreso tra 7 e 30 giorni. La conservazione per un periodo più esteso consente da un lato di avere sempre cornee a disposizione sia per interventi con carattere di urgenza, sia per poter programmare gli interventi di routine; dall'altro di poter eseguire test microbiologici sui terreni di coltura per aumentare le caratteristiche di sicurezza rispetto alle infezioni batteriche e fungine. Inoltre, la coltura d'organo è utilizzata per cornee che presentano alterazioni biologiche che le rendono non idonee al trapianto, le quali possono andare in contro a fenomeni di riparazione cellulare nel corso della coltura stessa. Tuttavia, in alcuni casi la coltura protratta per un lungo periodo può portare a un danno biologico per alcuni tessuti corneali, che può renderlo non idoneo per il trapianto perforante di cornea. Obiettivo di questa linea di ricerca è identificare marcatori biologici - e non solo morfologici - che indichino la qualità del tessuto corneale. La possibilità di utilizzare molecole identificabile e quantificabile che indirizzi verso un periodo di coltura diverso dal quello attualmente utilizzato, consentendo di ottenere una percentuale più elevata di cornee idonee al trapianto, rappresenterebbe un indubbio passo in avanti per miglior utilizzo delle cornee processate dalle banche degli occhi.